地下城堡3需要挑战的关卡涵盖主线章节、秘境副本、世界树区域及界域星河等多个板块，核心挑战集中在主线1-16章、四大秘境、世界树根部与神民之里等高难区域，每个板块都有专属BOSS与机制考验玩家阵容搭配与练度。
主线章节是核心挑战脉络，从时之尽头孤岛到汲魂之主的秘境，共16章关键关卡。前期新月郡、圣城修道院等章节难度平缓，BOSS如审判官巴斯蒂安、疯王等适合新手练手；中期熔炉之城萨古罗斯、银月谷车夫艾伦哈夫特等BOSS开始考验输出与治疗平衡；后期永恒焦土、阿克尤姆、空灵山学院等高难章节，BOSS如异世收割者、圣裁荣耀等，要求再生者等级140级以上、装备精炼20级，需搭配千面、魔骇、枯萎等强势阵容才能通关。
秘境副本是专属高难挑战，分为四层核心秘境与隐藏秘境。秘境1至秘境4分别对应枯萎的邪树、孤寂哨塔、巨兽之陨、卡巴拉树洞，最终BOSS邪树·卡巴拉、觅心箭·坎蒂丝等需针对性搭配暗语使徒、净化装备应对；隐藏秘境如西托比亚城邦，BOSS多为复数且带阵亡增伤机制，需优先击杀核心单位，练度不足可先收集资源暂缓挑战。
世界树根部与神民之里是后期终极挑战区域。世界树根部包含元素之殿、龙裔树屋、奇异地穴等关卡，元素之殿需击败寒霜、火焰、雷电三名祭司获取护盾，龙裔树屋BOSS带回血能力，需洗练敌方阵亡增伤词条；神民之里的神赐灵泉、气旋、元素之塔等关卡，BOSS有降低治疗、致盲等debuff，需双C带净化腰带，气旋关卡每步掉血20%，需控血探索避免暴毙。
